高效液相色譜儀使用注意事項(xiàng)

一、樣品制備與預(yù)處理注意事項(xiàng)

1. 樣品純度與溶解性

• 確保樣品溶解于流動相或兼容的溶劑中，避免懸浮顆粒或不溶物（否則會堵塞色譜柱、單向閥或進(jìn)樣器）。

• 若樣品含顆粒，必須經(jīng)0.22μm 或 0.45μm 濾膜過濾（根據(jù)色譜柱粒徑選擇，如 5μm 柱用 0.45μm 濾膜），過濾時(shí)使用一次性針式過濾器，避免交叉污染。

• 避免樣品中含有強(qiáng)腐蝕性物質(zhì)（如濃酸、濃堿）或與色譜柱固定相反應(yīng)的成分（如硅膠柱忌強(qiáng)堿，反相柱忌強(qiáng)極性溶劑過量）。

2. 樣品溶劑選擇

• 溶劑需與流動相互溶，避免因溶解度差異導(dǎo)致樣品析出（如流動相為水 - 甲醇，樣品溶劑若為純乙腈可能引發(fā)沉淀）。

• 溶劑強(qiáng)度不宜超過流動相（如反相色譜中，樣品溶劑為純甲醇，而流動相為 50% 甲醇 - 水，可能導(dǎo)致峰展寬或分裂）。

• 揮發(fā)性樣品需密封保存，避免溶劑揮發(fā)改變濃度。

二、流動相配制與使用注意事項(xiàng)

1. 流動相純度與處理

• 必須使用色譜純試劑（如甲醇、乙腈）和超純水（電阻率≥18.2MΩ?cm），避免雜質(zhì)污染色譜柱或檢測器。

• 含水流動相需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免長菌

• 緩沖鹽溶液（如磷酸鹽、醋酸鹽）需經(jīng)減壓抽濾（用 0.22μm 水系濾膜）并超聲脫氣 15-20 分鐘，去除氣泡（氣泡會導(dǎo)致泵壓不穩(wěn)、基線噪音或鬼峰）。

2. 流動相兼容性

• 混合不同溶劑時(shí)需緩慢攪拌，避免放熱或沉淀（如乙腈與水混合會放熱，需冷卻后使用）。

• 梯度洗脫時(shí)，兩種溶劑的互溶性需提前驗(yàn)證（如正己烷與甲醇部分不互溶，可能導(dǎo)致壓力驟升）。

• 更換流動相時(shí)，需用過渡溶劑沖洗系統(tǒng)（如從水相換為有機(jī)相，先用 50% 有機(jī)相過渡），避免固定相被破壞（如硅膠柱遇水膨脹，需逐步更換）。

3. 流動相儲存

• 含緩沖鹽的流動相需冷藏（4℃），使用前恢復(fù)至室溫并重新脫氣，避免溫度變化產(chǎn)生氣泡。

• 有機(jī)溶劑需密封避光保存，防止揮發(fā)或降解（如*易氧化生成過氧化物，需定期檢查）。

三、儀器操作核心注意事項(xiàng)

1. 泵系統(tǒng)操作

• 開機(jī)前確認(rèn)溶劑瓶內(nèi)有足夠流動相，輸液管路過濾器浸入溶劑（避免吸空進(jìn)氣）。

• 啟動泵前需排氣泡：打開排液閥，以 3-5mL/min 流速沖洗 1-2 分鐘，直至流出液無氣泡（注意不同溶劑的沖洗順序，避免沉淀）。

• 設(shè)定流速需逐步增加（如從 0.5mL/min 升至 1mL/min），避免瞬間高壓損壞泵或色譜柱；最大流速不超過色譜柱耐受范圍（如 4.6mm 內(nèi)徑柱通常≤1.5mL/min）。

• 泵壓異常時(shí)立即停機(jī)：正常壓力范圍因色譜柱和流動相而異，若突然升高（可能堵塞）或驟降（可能泄漏），需排查原因（如更換濾頭、檢查管路接頭）。

2. 進(jìn)樣系統(tǒng)操作

• 手動進(jìn)樣器：

• 進(jìn)樣前用樣品溶液沖洗進(jìn)樣針 5-10 次，避免殘留污染；針內(nèi)氣泡需排盡（針尖朝上輕彈）。

• 進(jìn)樣量不超過定量環(huán)體積的 50%（如 20μL 定量環(huán)，最大進(jìn)樣 10μL），否則會導(dǎo)致超載或峰展寬。

• 切換 “Load" 和 “Inject" 狀態(tài)時(shí)動作緩慢，避免壓力波動。

• 自動進(jìn)樣器：定期清潔樣品瓶和進(jìn)樣針，避免交叉污染；樣品盤需保持水平，防止樣品泄漏。

3. 色譜柱保護(hù)與使用

• 新柱使用前需用純?nèi)軇_洗（如反相柱用甲醇沖洗 30 分鐘），活化固定相。

• 加裝保護(hù)柱（與分析柱填料相同），減少樣品基質(zhì)對分析柱的污染。

• 每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需沖洗色譜柱：

• 含緩沖鹽的流動相：先用 10%-20% 甲醇 - 水沖洗 30 分鐘，去除鹽殘留（避免結(jié)晶堵塞），再用純甲醇 / 乙腈沖洗 30 分鐘保存。

• 反相柱長期保存需浸泡在純甲醇 / 乙腈中，正相柱需用正己烷保存，兩端密封防止干涸。

4. 檢測器操作

• 紫外檢測器（UV）：

• 開機(jī)后需預(yù)熱 30 分鐘，確保基線穩(wěn)定；檢測波長選擇樣品的最大吸收峰，避開流動相吸收波長（如甲醇截止波長 205nm，乙腈 190nm）。

• 流通池需保持清潔，若有氣泡可通過提高流速或輕敲池體排除；污染后可用稀硝酸或甲醇沖洗。

• 熒光檢測器：避免強(qiáng)光直射，樣品需有熒光活性或衍生化處理；激發(fā) / 發(fā)射波長需優(yōu)化以降低背景噪音。

• 檢測器出口管路需保持通暢，避免背壓過高（如管路打結(jié)會導(dǎo)致流通池?fù)p壞）。

四、關(guān)機(jī)與日常維護(hù)注意事項(xiàng)

1. 正確關(guān)機(jī)步驟

• 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，按 “流動相沖洗→停泵→關(guān)檢測器→關(guān)主機(jī)" 順序操作，禁止直接斷電。

• 若長期不用，需將泵內(nèi)和色譜柱中的緩沖鹽沖洗干凈，防止結(jié)晶堵塞；溶劑瓶內(nèi)灌滿純?nèi)軇ㄈ缂状迹苊獗妹芊饧珊岳匣?/p>

2. 日常維護(hù)要點(diǎn)

• 每周檢查輸液管路是否有漏液、老化，及時(shí)更換破損管路（尤其是接頭處）。

• 每月清潔泵的單向閥：若出現(xiàn)壓力不穩(wěn)或流量不準(zhǔn)，可拆卸單向閥用甲醇超聲清洗（注意區(qū)分進(jìn)出口方向）。

• 定期校準(zhǔn)儀器：如泵的流量準(zhǔn)確度、檢測器的波長精度和靈敏度（用標(biāo)準(zhǔn)品如萘的甲醇溶液校準(zhǔn) UV 檢測器）。

• 保持儀器清潔：樣品溢出后立即用有機(jī)溶劑擦拭，避免腐蝕儀器表面；色譜柱存放于專用柱盒，避免碰撞。

五、安全注意事項(xiàng)

• 有機(jī)溶劑（如甲醇、乙腈）具有毒性和易燃性，需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作，遠(yuǎn)離火源，佩戴手套和護(hù)目鏡。

• 高壓系統(tǒng)（泵壓通常 0-40MPa）運(yùn)行時(shí)禁止拆卸管路或接頭，防止液體噴射傷人。

• 接觸生物樣品或有毒介質(zhì)后，需清潔進(jìn)樣針、樣品瓶等，避免交叉污染或健康風(fēng)險(xiǎn)。

遵循以上注意事項(xiàng)可有效延長儀器壽命、保證分析結(jié)果的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性。操作前務(wù)必熟悉所用 HPLC 型號的說明書，針對特殊配件（如制備柱、蒸發(fā)光檢測器）需額外注意其專用規(guī)范。